惰性C-H键的选择性氧化为复杂天然产物和药物分子的合成设计和结构修饰提供了新的思路。但如何实现众多C-H键的特异性区分仍然具有较高挑战，无导向的C-H键氧化受到底物电子效应和位阻效应等因素影响，只能作用于相对富电子的次甲基或亚甲基。而甲基C-H键由于键解离能（BDE）更高而格外惰性，现有化学合成方法依赖预装的定位基团才能突破这一限制。近日，复旦大学药学院天然药物学系陈道峰和李付琸等人以细胞色素P450单加氧酶P450BM3为基础，通过半理性定向进化等工程化改造构建了Ox18系列酶催化平台，实现了二萜天然手性原料sclareol中惰性C18-甲基C–H键的高选择性氧化，并进一步用于复杂天然产物spiromyrrhene B的首次合成。相关研究成果以“Selective C18-Methyl Oxidation of Sclareol via an Engineered P450 Enables the Synthesis of Spiromyrrhene B”为题发表于Journal of the American Chemical Society。
研究团队以P450BM3 F87V作为起点，围绕底物结合口袋开展定向进化，通过调节活性口袋内多个关键残基的协同作用，打破了选择性与催化活性之间的trade off现象。最终，通过五轮突变获得最佳变体Ox18M3-3，与初始F87V相比C18氧化选择性由4%提升至超过99%，同时催化活性提高约2.2；并仅用两个精简双突变体（Ox3M1、Ox6M1）就实现了C3、C6两个亚甲基位点的选择性控制。随后的机制解析显示，这一最优突变体通过氢键锚定与疏水相互作用协同限制底物构象，使C18-甲基稳定靠近血红素铁氧活性中心，从而形成有利于氧化反应发生的几何构象，突破甲基直接氧化难以实现的限制。定向进化建立的系列酶库能够识别多种sclareol衍生物，并对部分具有不同侧链长度和官能团修饰的衍生物保持良好的C18氧化选择性和转化效率，体现出在复杂天然产物合成与后期结构修饰中的应用潜力。
为了进一步验证该方法在复杂天然产物合成中的应用价值，研究团队实现了这一酶催化转化的克级规模制备，并结合Rh催化的不对称加氢酰化、分子间Diels-Alder环加成等关键反应以10步最长线性路线（LLS）实现了传统中药没药中分离得到的具有出色抗肿瘤活性的二萜-倍半萜杂二聚体spiromyrrhene B的首次合成。
复旦大学药学院博士生张晨昊、刘书功、陈冠文为该论文的共同第一作者，李付琸副教授、陈道峰教授为论文共同通讯作者。该工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金等项目的支持。
（供稿：天然药物学系）
