荧光成像显微镜是生命科学和医药学研究的基本工具。超分辨显微成像技术,如受激辐射损耗(STED)显微术，突破传统显微镜200纳米分辨率极限，可在数十甚至数纳米尺度观测细胞微观结构，为蛋白功能研究、靶标蛋白追踪和药物开发等领域提供了新的机遇。相较于成像技术的进步，标记探针的发展略显滞后。在STED成像中，理想的荧光探针应具备以下几个方面的优点。（1）较高的亮度，实现对低丰度的靶标蛋白的可视化；（2）优异的光稳定性，在STED高能激光照射下进行长时间示踪和高保真成像；（3）较长的Stokes位移，增加成像的信噪比和降低由STED激光造成的二次激发；（4）不同的激发或发射波长，能够同时检测多个靶标蛋白的动态变化。除此之外，染料应具有高细胞膜通透性，进而可用于活细胞成像。如何开发可用于STED成像的高性能荧光探针是超分辨成像领域亟需解决的问题。
罗丹明染料及其衍生物具有其优越的光学性质和细胞通透性，是活细胞超分辨成像的首选探针。德国马克斯普朗克Kai Johnsson课题组和复旦大学王璐课题组通过调控罗丹明“开-闭”环动态平衡，开发出高细胞通透性、蛋白响应型系列荧光探针（MaP探针），可满足受激辐射损耗(STED)显微术和单分子定位成像（SMLM）的不同要求；霍华德·休斯医学研究所 (HHMI)的 Luke Lavis课题组、大连理工大学肖义课题组等通过结构调控抑制TICT作用提升染料的亮度及光稳定性；湖南大学袁林课题组引入不对称结构可增加染料的Stokes位移等。然而，以上修饰方法往往只提升了染料的一两种荧光性质，难以同时提升几项性能以用于活细胞STED成像。
面对此难题，复旦大学王璐课题组联手湖南大学袁林课题组提出了一种同时提升染料多个性能的新策略（图1），将抑制TICT作用策略和不对称染料体系策略相结合，可同时改进染料亮度、光稳定性以及Stokes位移。
图1. 新型设计策略用于同时提升染料的亮度、光稳定性及Stokes位移。B，P和Δ分别代表亮度，光稳定性和Stokes位移
图2. YLs染料的合成及光谱性质
基于以上协同策略，作者开发了YueLu染料（YLs）。通过引入四氢吡嗪基团使染料的HOMO轨道表现出不对称的电子云分布，同时引入不同Hammett常数的取代基精确调控四氢吡嗪端的电子云密度，增加染料激发态振动弛豫并抑制分子内扭转电荷转移（TICT），进而协同增加染料的光稳定性、亮度以及Stokes位移（图2a-b）。体外测试证明，相较于罗丹明B， YL578染料具有更好的光稳定性、亮度以及Stokes位移(图2c-2h)。
图3. YL578衍生物成功用于高信噪比活细胞成像
为了将YL578用于蛋白质特异性标记，作者将HaloTag底物偶联在YL578上，构建了用于标记Halo蛋白的荧光探针(图3a-3f)。相较于RhB-Halo，YL578-Halo不仅具有更高光稳定性，而且在免洗标记中也展示出更高的成像信噪比。通过对YL578染料的简单修饰，也可构建出用于活细胞中线粒体和溶酶体的特异性标记和实时成像的荧光探针(图3g-3j)。
图4. 高光稳定性YL578-Halo探针用于3D-STED成像及活细胞STED成像。
为了进一步验证YL578染料在STED成像中的光稳定性，作者将其与STED成像探针580CP-Halo、JF608-Halo、CPY-Halo进行同条件比较。在固定细胞中的波形蛋白STED成像中，在同样的损耗激光条件下（775 nm），580CP-Halo、JF608-Halo及CPY-Halo仅在2-3帧成像后，其亮度会衰减至最初亮度的50%以下，而YL578-Halo在9帧之后仍具有50%以上亮度，且可维持波形蛋白57±5 nm成像分辨率。由于YL578染料突出的光稳定性，作者将其用于了线粒体输入受体Tomm20蛋白的3D-STED超分辨成像。同时，得益于其较大的Stokes位移，YL578-Halo可以与MaP555-actin及GeR-tubulin联用实现细胞骨架的三色STED超分辨成像。
表1. 拓展染料与对应参比染料的荧光性质对比
最后，作者也将该策略拓展至其他染料骨架，设计合成了一系列具有大Stokes位移的明亮、光稳定的荧光染料，并将它们用于生物成像及传感。作者认为，此项工作通过不同设计策略的协同，可同时改进多种光学性质以满足特定的成像要求，为后续染料的开发提供了重要思路。
湖南大学袁林教授和复旦大学王璐青年研究员为共同通讯作者。湖南大学化学化工学院博士研究生蒋钢威和任天兵博士为文章的共同第一作者。该项目的完成得到了国家自然科学基金、复旦大学科研启动基金和湖南省科技计划等基金的支持。
王璐课题组介绍
王璐，复旦大学药学院青年研究员，博士生导师，获得国家海外高层次引进人才项目和复旦大学人才引进项目资助。2010-2013年复旦大学硕士，2013-2017年新加坡国立大学博士，2017-2021年以“洪堡学者”完成德国马克思普朗克医学研究所博士后研究。长期从事荧光探针的开发及蛋白标记、超分辨成像、重要代谢成像追踪分析等相关研究工作，以第一作者或者通讯作者在Nat Chem (2020)、Nat Comm (2022)、JACS（2015,2016,2019,2021）、Angew. Chem. (2016,2020)等学术期刊上发表论文14篇。开发超分辨成像荧光探针等工具已被spirochrome、sigma等公司商业化，并全球销售。
课题组主页：https://www.x-mol.com/groups/luwangfd
王璐课题组常年招收博士后（30-50万/年）和博士，欢迎感兴趣的同学加入！
