Adv. Sci.“泾渭分明”定位肿瘤“代谢边界”导航脑胶质瘤手术

发布时间:2022-01-19阅读次数:825

脑胶质瘤是最常见的脑部原发性恶性肿瘤,已经成为我国青少年发病率最高的肿瘤。由于胶质瘤脑内浸润性生长,临床磁共振、CT等影像技术难以准确定位肿瘤边界。手术无法完整切除肿瘤浸润区域是导致其高复发率、高死亡率的重要原因。癌细胞高水平葡萄糖酵解导致细胞外液酸化是几乎所有固体肿瘤的典型特征,此外,微环境酸化在肿瘤细胞的干性维持、表型筛选、浸润侵袭和免疫逃避等过程中均发挥重要作用。由于组织外液酸化与恶性程度之间具有时空相关性,术中定位代谢酸化边界为胶质瘤完整切除提供了新途径。传统电极插入式酸度计测量组织pH易造成脑功能损伤。外源性pH响应荧光探针转化周期长,且目前临床尚未有上市药物。化学交换饱和转移等磁共振成像技术可以无创测量脑部pH,但是其空间分辨率低,操作复杂,速度慢等特点限制其术中使用。因此,构建术中无损、快速划定肿瘤酸化区域的技术是亟待解决的问题。近日,复旦大学药学院李聪教授、类脑智能科学与技术研究院张孝勇研究员、信息科学与技术学院余锦华教授以及附属华山医院神经外科毛颖教授联合研究团队构建了一类术中无损提取组织表面代谢物并定位胶质瘤“代谢酸化边界”的导航系统。该成果以《智能拉曼导航系统术中划定酸化区域引导脑肿瘤切除》(Intelligent SERS Navigation System Guiding Brain Tumor Surgery by Intraoperatively Delineating the Metabolic Acidosis)为题发表在《先进科学》(Advanced Science)杂志。

  

该系统由自主研制的pH响应表面增强拉曼散射(SERS)芯片,手持式拉曼光谱仪以及深度学习模型组成。本工作揭示了报告分子诱导表面增强拉曼共振效应新原理,并根据该原理制备了SERS芯片,实现了组织微量样本pH值的定量测定。提出了水滴辅助组织取样技术,可将肿瘤组织表面的代谢物无损地转移到SERS芯片上。拉曼光谱仪采集液滴样品在SERS芯片上拉曼信号。自主构建的深度学习模型自动分析样本拉曼光谱信号并准确、快速地测定样品pH值。该智能SERS导航系统可在6分钟内对64个组织位点(约1 cm2pH进行测量,并通过绘制手术切面pH分布图定位肿瘤“酸性代谢边界”。与临床磁共振导航技术相比,“代谢边界”手术导航策略可显著提高大鼠胶质瘤模型存活率,延缓了肿瘤复发速度。此外,分析5例病人胶质瘤组织样本,揭示了组织酸化程度与癌细胞密度之间的相关性。该设备能够准确、快速定位胶质瘤浸润性边界,对降低阳性边界率,改善手术预后具有重要价值。此外,该SERS导航系统无需注射外源性探针,临床能够加速临床转化。


1. 智能拉曼手术导航系统示意图。使用水滴辅助组织取样技术无损提取组织表面代谢物并滴加到SERS芯片上,采集液滴样本SERS光谱并输入深度学习模型中分析。快速、准确绘制组织pH分布图并引导手术切除。

  

本工作利用了静电自组装和原位生长方法制备了一种基于纳米金星基底的SERS芯片。如图2所示,首先将硅片氨基化修饰,使其带上正电荷。吸附带负电的纳米金球,之后取出置于氯金酸溶液中处理,金纳米球生长为金纳米星形状。最后将金纳米星芯片表面修饰一层报告分子IR7p。扫描电子显微镜照片显示,经过生长处理的金纳米星芯片的颗粒直径增加到70 nm。纳米金颗粒随机均匀排布在硅片上,形成亚单层结构,表明SERS芯片具有较好的均匀性。

  

  

2. SERS芯片构建过程示意图。(A)作为七甲川花菁衍生物,拉曼报告分子IR7p在质子化和脱质子化状态之间呈现可逆颜色变化。(B)(i2% APTES乙醇溶液、0.2 M HCl;(ii)金纳米球;(iii0.3 mM HAuCl475 mM HEPES溶液(pH 7.4)。(CSERS芯片的扫描电镜图。

  

拉曼报告分子IR7p最大吸收随着酸化发生红移SERS芯片的拉曼信号也随着pH 发生比率改变。其中311 cm-1处的拉曼峰基本保持不变,而其他的所有峰呈现不同程度的增强。通过测量pH响应和非响应拉曼峰强度间比值,可以计算对应样本的pH。当液滴样本pH酸化至6.0时,报告分子吸收与激发波长(785 nm)接近,共振拉曼效应极大增强了共轭基团的拉曼散射信号,而对非共轭基团几乎无影响。此外,通过分子最低能量模拟计算发现,质子化的IR7p分子的共面性更好,提高了共轭基团的拉曼散射截面。以上两个机制共同作用,产生了拉曼信号的pH比率响应现象。

  

  

3. SERS芯片pH响应拉曼信号的可能机制。(A)报告分子表现pH依赖吸收光谱。(BSERS芯片表现pH依赖的表面增强拉曼光谱。(C)报告分子的共振拉曼效应。(D)分子内构象扭转效应。

  

将拉曼光谱数据库中80%数据用于训练,20%的数据作为测试集,测试结果发现,深度学习模型对于pH结果计算的准确度显著高于传统模型,p值小于0.001。对于不同批次的SERS芯片,深度学习模型也能根据pH误差准确识别归类并自动校正,综上所述,深度学习模型相比传统模型具有更好的准确性和鲁棒性

  

  

4. 构建拉曼光谱深度学习模型计算检测样本pH值。(A)深度学习模型构建示意图。(B)深度学习模型测定pH准确度显著高于传统模型。(C)深度学习模型可以根据pH误差准确归类SERS芯片并实现自动校正。

  

利用琼脂糖凝胶作为体外模拟组织优化智能拉曼系统检测pH策略。移液枪吸取一定量的纯水,与凝胶接触,凝胶表面的代谢物即溶解扩散到纯水中,将得到的样本滴加到表面增强拉曼芯片上,采集液滴区域的SERS光谱并计算pH。研究发现在取样体积0.4 μL,接触时间2 s的条件下,对于缓冲容量大于等于5.5 mEq/L/pH的琼脂糖凝胶模拟组织,本拉曼系统均能准确测定其pH,误差小于0.22 pH单位,单样检测时间小于4 s


  

5. 智能拉曼系统组织检测指标的优化。(A)水滴辅助组织取样技术的操作过程。缓冲容量(B)、取样体积(C)和接触时间(D)对检测结果影响。(E)拉曼系统检测结果与pH计读数一致。单个芯片内(F)与多个芯片间(G)对同一样本检测结果分布直方图。

  

将该拉曼导航系统应用于大鼠原位胶质瘤模型的手术。打开颅骨和脑膜暴露肿瘤组织,使用移液枪吸取一定量超纯水并与组织表面轻压接触2 s,无损提取肿瘤组织表面代谢物,再滴加到新构建SERS芯片上。采集样本液滴区域SERS光谱,输入深度学习系统分析,术中绘制pH分布图。可以看到随着手术的进行,酸性区域不断被切除,直至所有pH<7.0的区域均被切除。在大鼠胶质瘤切片中,发现了肿瘤恶性程度与酸化的相关性。


  

6. 酸性代谢边界导航大鼠胶质瘤模型手术改善预后。(A)代表性的磁共振影像。(B)对应的冠状面H&E染色切片。(C)术后肿瘤体积变化。(D)生存率曲线。(E)体重曲线。


  

根据MRI影像计算大鼠肿瘤体积变化,未手术组及磁共振钆剂导航组的肿瘤体积呈现近似指数型增长,而拉曼系统导航组(绿色线)中,模型复发速度显著低于术前钆剂导航组。在生存率方面,智能拉曼导航组60%的动物模型实现肿瘤完全切除,生存时间超过180天,也显著高于其他2组。可以得出结论:酸性代谢边界导航显著改善大鼠胶质瘤模型的手术预后。


  

7. 酸性代谢边界导航显著改善大鼠胶质瘤模型的手术预后。(A)拉曼系统导航组的大鼠脑部手术前后的磁共振影像。(B)对应的H&E染色切片。各组大鼠模型的肿瘤体积(C)、生存曲线(D)和体重曲线(E)。

  

利用该设备,我们在华山医院神经外科对5例胶质瘤病人进行了酸代谢边界可视化临床研究。与正常组织相比,胶质瘤组织普遍酸化明显,pH值降到6.2-7.0范围内。酸化区域癌细胞密度显著高于未酸化区域。代谢可视化技术验证了临床组织酸化水平与恶性程度间的相关性,实现了肿瘤浸润区域从结构边界看不准到代谢边界看得准的转变,为该技术的临床转化提供了可行性依据。


  

8. 胶质瘤病人切除样本中发现了组织酸化与恶性程度间相关性。(A)切除肿瘤样本的照片与pH map。(B)不同pH下肿瘤组织的H&EKi67染色。(C)肿瘤细胞密度和Ki67阳性率与酸化程度关系。

  

总结:

本工作构建了一类基于表面增强拉曼散射(SERS)技术的智能手术导航系统,能术中无损、快速定位肿瘤酸性代谢边界,导航脑胶质瘤切除。在动物水平验证了代谢边界导航手术策略能够显著改善预后。在病人肿瘤样本上验证了临床组织酸化水平与恶性程度间的相关性。主要创新点在于:(1)揭示了报告分子诱导表面增强拉曼共振效应新原理,指导比率响应型拉曼芯片的设计;(2)提出了定位“代谢酸化边界”导航浸润性肿瘤手术新策略,提高胶质瘤手术预后;(3)构建了不依赖外源性探针的智能拉曼导航系统,为“代谢酸化边界”导航手术策略的临床转化提供了工具;

  

复旦大学药学院博士生金子义、华山医院神经外科岳琪主治医师、药学院博士生段文佳以及电子工程系硕士生隋安该论文的共同第一作者。复旦大学附属华山医院神经外科毛颖教授、复旦大学电子工程系余锦华教授、类脑智能科学与技术研究院张孝勇研究员以及药学院李聪教授为论文的共同通讯作者。研究获得国家重点研发计划,国家杰出青年基金,上海市脑与类脑智能基础转化应用研究市级科技重大专项,上海市科学技术委员会和复旦大学双一流项目支持。

  

原文链接:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202104935

  

  

Adv. Sci., 2022, DOI: 10.1002/advs.202102303