还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸2′-磷酸（NADPH）是生命体中最重要的辅酶之一，参与调控生理病理条件下的合成代谢反应和氧化还原平衡。探索活细胞内NADPH的时空动态变化和代谢机制，对NADPH代谢相关的疾病研究具有重大意义。然而，由于其结构复杂且与NADP+和NADH等代谢分子高度相似，目前在活细胞内对NADPH实时动态监测仍存在挑战。
FRET比率型荧光探针是活细胞水平定量检测代谢物动态变化的有力工具。近年来，通过有机染料与蛋白质结合而构建的化学-遗传编码探针为代谢分子检测提供了新的技术平台。此类探针结合了有机荧光染料的高光稳定性、颜色选择灵活性和高亮度，以及蛋白质的可控靶向表达和高选择性，为代谢分子检测提供了新一代的可视化工具。然而，化学-遗传编码探针仍面临蛋白质标记效率低、响应范围小等问题。
王璐课题组前期工作中开发了一类蛋白响应型荧光探针，其在游离状态下无荧光且脂溶性强，能够快速跨膜并在细胞内保持低背景信号。当该探针与目标蛋白（如HaloTag、SNAP-tag、微管蛋白和F-actin等）结合后，染料结构从“闭环”转变为“开环”，导致荧光信号增强可达数百倍（图1a）（Nat Chem 2020, Nat Comm 2022, Angew Chem Int Ed 2021），实现了活细胞内高信噪比的靶标蛋白免洗成像。
在本项工作中，王璐课题组基于蛋白响应型荧光染料构建了新一代化学遗传编码探针（FOCS Fluorogenic rhodamine-based Chemigenetic biosensor），包括小分子化学探针和标签/识别蛋白（图1b）。小分子探针由绿色供体染料和红色受体染料构成，游离状态下无荧光。探针与标签蛋白结合后发射绿色荧光；而NADPH会促进小分子探针与识别蛋白结合，发射红色荧光，通过红/绿色比值实现NADPH的比率检测。两种染料通过一步标记1:1结合到融合蛋白标签上，可实现免洗标记并产生高特异性的FRET比率荧光信号。
图1 化学遗传编码探针FOCS设计思路和工作原理
体外滴定结果显示，FOCS-NADPH探针可以快速、特异性、可逆地检测NADPH，不受其他代谢分子（如NADH、NADP+、ATP等）和pH变化的干扰（图2）。HEK293T活细胞成像表明，此类蛋白响应型荧光探针背景信号极低，在免洗条件下即可实现蛋白标记和胞内化学遗传编码探针的构建。
图2 FOCS-NADPH探针快速、特异性、可逆地检测NADPH
在肿瘤活细胞成像中，，FOCS-NADPH探针能够动态监测氧化应激条件下NADPH浓度波动，揭示肿瘤细胞中磷酸戊糖途径对NADPH稳态的调控作用（图4a-4c）。此外，该探针还可用于顺铂、硫代烟酰胺、表没食子儿茶素没食子酸酯等药物下NADPH浓度的监测（图4d），为抗肿瘤药物联用筛选和机制研究提供了可视化工具。
图3 FOCS-NADPH探针用于活细胞NADPH动态监测
复旦大学王璐青年研究员、德国马普所Kai Johnsson教授和中山医院周平红教授为论文的通讯作者。复旦大学药学院博士研究生常慧敏、德国马普所Simon Clemens博士、中山医院郜娉婷青年研究员、中山医院李全林副教授为该论文的共同第一作者。该工作获得国家自然科学基金项目、上海市基础研究特区规划项目、马克斯普朗克学会项目等的支持。
王璐课题组介绍
王璐，复旦大学药学院青年研究员，博士生导师，获得国家海外高层次引进人才项目。2010-2013年复旦大学硕士，2013-2017年新加坡国立大学博士，2017-2021年以“洪堡学者”完成德国马克思普朗克医学研究所博士后研究。长期从事荧光探针的开发及蛋白标记、超分辨成像、活细胞代谢分子成像等相关研究工作，以第一作者或者通讯作者在Nat Chem (2020)、Nat Comm (2022)、JACS（2015,2016,2019,2021,2024）、Angew. Chem. (2016,2020,2023)等学术期刊上发表论文20余篇。开发超分辨成像荧光探针等工具已被spirochrome等公司商业化，并全球销售。
课题组主页：https://www.x-mol.com/groups/luwangfd
王璐课题组2025年招收荧光染料合成方向博士研究生1名，欢迎感兴趣的同学加入！
