黑色素瘤是强侵袭性皮肤恶性肿瘤，手术切除是早期患者的重要治疗手段。如何在充分清除肿瘤的同时尽可能保留正常功能组织，是手术面临的关键问题。黑色素瘤的肉眼可见边界与实际浸润范围并不完全一致：色素分布不均、低色素或无色素病变，肿瘤高度异质性、以及卫星灶的隐匿性扩展，均可能增加切缘判断难度。切除不足留下残余肿瘤导致快速复发，过度切除则会增加功能损伤并影响外观，尤其是头颈部及肢端部位。因此，在肉眼可见边界之外引入反映病变状态的功能性信息，将为精准定位切缘提供关键依据。
癌细胞葡萄糖酵解代谢途径导致组织外液酸化为解决该问题提供了新途径。对肿瘤及其周边组织pH进行定量测绘，有望将这种不易被肉眼观察到的代谢性差异转化为可读的空间信息，辅助识别肿瘤区域及其边缘过渡带。但酸化并非黑色素瘤所独有，如何准确测量、合理解释组织中的酸度差异，并将其与病理学证据对应，是推动该策略应用的必要前提。
实现术中组织切缘pH的快速空间测量仍面临多方面挑战。传统电极测量在接触方式和空间采样方面存在限制，荧光探针的光学读出则可能受到组织背景及色素的影响。表面增强拉曼散射（SERS）借助贵金属表面等离子共振放大分子振动信号，能够以“分子指纹图谱”形式反馈组织化学状态。将组织表面微量水滴采样与SERS阵列结合，可在离体检测界面完成pH等分子信息读出，为新鲜切除样本的快速检测提供可行路径。然而，要将该策略用于复杂组织样本还需要同时解决拉曼光谱信息利 用不足和检测质量不稳定等问题。
基于细胞外液酸化是几乎所有肿瘤的共同特征，本课题组前期报道了系列pH响应报告元件，将上述元件键连到拉曼阵列表面，实现了包括脑胶质瘤、前列腺癌、肾癌等病人肿瘤代谢分子边界的快速判断。pH响应拉曼元件的质子化过程往往同时影响多个振动模式，表现为多个拉曼谱带之间相互关联的强度变化。传统分析通常依赖少数（2个）特征峰或固定峰比，容易遗漏分布在全谱中的协同信息。此外，常规数据驱动模型虽然能够利用更多光谱特征，但如果缺少化学结构对质子响应的引导，其对异常光谱的识别和解释能力仍显不足。此外，SERS基底局部差异、背景干扰与采集波动也可能导致低可信度读数。由此，如何将分子响应机制、全谱解析和读数质量控制贯通，成为提高组织代谢分子测量可靠性的核心问题。
近日，复旦大学药学院李聪教授、王璐青年研究员，复旦大学附属中山医院顾建英教授联合研究团队，在ACS Sensors发表题为“Chemically Informed Artificial Intelligence Decoding of Full-Spectrum SERS Fingerprints for pH-Guided Intraoperative Assessment of Freshly Excised Melanoma Specimens”的研究型论文。该研究构建了化学先验引导的人工智能SERS平台，将pH响应型报告元件、全谱多峰注意力模型与质量控制引导的复测流程相结合，实现新鲜黑色素瘤切除临床样本的快速pH空间测绘，为术中肿瘤切缘定位提供了新的信息获取方法。
平台工作流程包括四个环节（图1）：首先，以微量纯水水滴接触组织表面，获得局部样本；随后，将回收液滴转移至pH响应报告元件修饰的SERS微阵列，并采集其拉曼光谱；第三，利用化学先验引导的多峰注意力模型CIMPA-pH同步输出pH预测值与读数风险，对低可信度光谱进行针对性自动复测；最后，根据离散采样点的pH检测结果重建组织表面酸度分布。该策略将pH响应的分子机制纳入AI解析过程，同时为每次预测提供质量判断，使空间测绘不仅获得数值，也能够识别需要重复核验的读数。
图1. 化学先验引导的AI-SERS平台及黑色素瘤临床标本测绘流程。（1）采用水滴接触方式进行切除组织表面局部取样。（2）将液滴转移至pH响应型SERS阵列，通过785 nm激光激发获得拉曼光谱。（3）CIMPA-pH融合全谱注意力与化学响应先验，输出pH及读数可信度，并引导低可信度光谱复测。（4）重建组织酸度分布，为切缘评估提供功能性线索。图示手术引导为拟应用场景，本研究的组织验证在新鲜切除标本上完成。
可靠的pH读出首先需要可解释的分子结构响应。研究团队设计了基于磺酸化半花菁-氧杂蒽类结构的拉曼报告分子HemS，通过硫辛酸锚定基团将其固定于金纳米结构表面，并利用酚羟基的质子化与去质子化过程感知酸碱变化。阵列制备采用分步构建策略：先将金纳米球组装于硅片表面，再原位生长为多分支金纳米星，最后进行HemS功能化修饰。纳米星尖端及颗粒间隙提供局域电磁增强区域，为表面分子的振动信号读出创造条件（图2）。
光谱表征与量子化学计算揭示了HemS的多峰响应机制。随着pH变化，分子的电子分布和共轭结构发生调整，多个振动模式随之呈现协同的强度变化：1252、1437 cm⁻¹等谱带与质子化状态相关，589、681、834 cm⁻¹等谱带则在去质子化状态下表现出变化，而931 cm⁻¹等谱带信号相对稳定。静电势分布和振动模式分析为这些响应提供了分子层面解释，也表明pH信息分布于多个谱带之中，为后续建立化学先验引导的全谱模型奠定了基础。
图2. pH响应型SERS微阵列的构建、表征与全谱响应机制。（A）金纳米球组装、原位生长为金纳米星及HemS修饰流程，右侧为HemS结构。（B）不同制备阶段的扫描电镜图像。（C）不同pH条件下HemS的紫外-可见吸收光谱。（D）酸性与中性条件下的分子静电势分布。（E）表面固定HemS报告元件的质子化与去质子化状态、代表性拉曼响应及振动模式归属，展示pH引起的多谱带强度重分配；实验光谱为5次重复测量的平均结果。
在明确分子响应机制后，团队系统比较了不同拉曼特征的pH定量能力。在pH 4.0‒9.0范围内，HemS-SERS阵列表现出连续的多峰响应。以相对稳定的931 cm⁻¹谱带作为参照，研究人员综合动态范围、变异系数及相邻pH区间的区分能力，对单一峰比和多峰组合进行筛选。其中，多峰组合R3＝（I₅₈₉＋I₆₈₁－I₁₂₅₂）/I₉₃₁同时利用了不同响应方向的谱带，在全范围和近中性范围内的拟合决定系数分别达到0.9961和0.9399。在所测试的离子、氨基酸及蛋白等条件下，多峰组合R3较单一峰比表现出更稳定的响应（图3）。
谱带相关性分析显示，低pH与高pH条件下的峰间关联存在差异，pH 6与pH 8之间的差异相关网络也呈现出多谱带协同变化。这说明，固定峰比虽能改善定量表现，仍难以完整描述不同酸碱状态下的全谱关联。研究由此将分析对象从少数人工选定的特征谱带扩展至完整拉曼光谱，同时保留局部峰强变化和跨谱带关联，使模型能够更充分地利用分子响应信息。
图3. HemS-SERS微阵列的多峰pH响应、特征筛选及定量校准。（A）pH 4.0‒9.0范围内的SERS光谱。（B）以931 cm⁻¹为参照的特征峰比响应热图。（C、D）基于动态范围、变异系数及相邻pH区间区分能力的候选特征筛选。（E）最优组合信号R3的校准曲线，插图为近中性范围拟合。（F）R3与单一峰比在所测试条件下的归一化响应。（G、H）低、高pH组内的谱带相关性。（I）pH 6与pH 8之间的谱带差异及相关网络变化。
为实现可解释的全谱定量，团队开发了化学先验引导的多峰注意力模型CIMPA-pH（图4）。模型依据量子化学计算与实验光谱识别的pH响应振动模式，初始化可学习的化学先验；通过级联Swin Transformer提取光谱特征，再以交叉注意力将分子响应规律与数据表征融合，并在Henderson–Hasselbalch酸碱平衡关系约束下输出pH。化学先验可在训练过程中逐步调整，使模型既关注具有明确化学意义的谱区，也保留适应实际光谱差异的能力。
研究建立了包含10500条光谱的数据库，并按独立制备批次划分训练、验证和测试数据。在测试集上，模型按各参考pH组汇总预测值后的R²为0.999，均方根误差（RMSE）为0.036 pH单位；该汇总层面的RMSE较人工峰比分析降低约85%，较所比较的1D-Swin Transformer和ResNet 1D模型降低约54%‒78%。同时，五模型集成结合预测不确定性与模型间分歧生成质量控制评分。风险越高，单条光谱的预测误差总体越大，为识别异常读数及后续复测提供了依据。
图4. CIMPA-pH的全谱解析机制、模型结构与预测性能。（A）峰比分析与全谱分析对比。（B）模型结构。（C）不同pH下的谱区贡献。（D）初始锚定与训练后学习的化学先验。（E、F）与人工峰比及基线深度学习模型的性能比较。（G、H）预测误差与质量控制风险的关系。测试集含1050条光谱，覆盖7个参考pH；E、F的RMSE及H标注的汇总MAE在各参考pH组预测值取平均后计算，G、H的误差分布则基于单条光谱。
获得预测数值之后，如何判断一次读数是否可靠，是SERS平台面向组织测绘的另一关键环节。研究团队依据验证集风险评分的第70和第90百分位，将读数划分为低、中、高风险，并建立质量控制引导的针对性复测流程（图5）。来自6个独立批次阵列的600次测量显示，读数风险与绝对误差具有一致的变化趋势。对于中、高风险光谱，系统在同一液滴覆盖的阵列区域内改变采集位置并重复测量：转为低风险的读数结束复测，仍不满足要求的读数继续核验，从而减少局部采集波动对结果的影响。
质量分层也改善了保留读数的误差分布。在排除中、高风险读数的分析中，绝对误差超过0.1 pH单位的读数比例由8.00%下降至5.67%，相对降低约29.1%。这一结果体现的是质量筛选对高误差读数的控制效果，与邻近位置复测共同构成平台的可靠性保障。研究还发现，阵列储存时间延长会增加初始及复测后残留的高风险比例，提示应将阵列存放时间纳入检测流程管理。由此，CIMPA-pH不仅承担pH计算，也参与判断何时需要重新采集数据。
图5. 基于CIMPA-pH的质量控制、针对性复测及分层误差管理。（A）质量控制引导的复测流程。（B）10×10测点阵列的风险空间分布。（C）6个独立批次阵列共600个测量点的分层误差。（D、E）高、中风险读数在邻近位置复测过程中的保留、终止及对应误差，邻近位置均位于同一液滴覆盖的阵列区域。（F）不同质量筛选策略下，超过指定误差阈值的读数比例。（G）阵列储存时间与初始、复测后残留高风险比例的关系。
为检验平台在不同色素表型中的适用性，团队分别构建了B16F10有色素与A375无色素黑色素瘤小鼠模型，对切除标本的肿瘤、邻近皮肤及远端正常皮肤进行pH测绘（图6）。两种模型均呈现出由远端正常皮肤、肿瘤邻近皮肤至肿瘤组织逐步降低的pH梯度。以每只小鼠各类组织测点的平均值进行统计后，两种模型的组织类别间差异仍然成立。平台还捕捉到肿瘤内部的局部酸度差异，部分更酸区域在对应病理切片中呈现较高的细胞密度和更明显的异型性。
在独立动物队列中，CIMPA-pH与同一组织位点的参考光学pH微传感器测量结果具有较好一致性，一致性相关系数（CCC）为0.98，平均绝对误差（MAE）为0.08 pH单位；对同一提取液进行比较时，CCC为0.99，MAE为0.04 pH单位。切除后的时间稳定性实验进一步显示，所测试B16F10组织及远端正常皮肤的pH在至少25分钟内相对稳定。上述结果支持该平台在不同色素表型下获取肿瘤相关酸化信息，并为新鲜标本的空间测绘提供了实验依据。
图6. 有色素与无色素黑色素瘤动物模型的pH空间测绘。（A）模型与检测流程。（B）代表性切除标本明场图。（C）对应pH分布，连续色彩图由离散测点插值得到，仅用于可视化。（D）代表性点位的H&E染色；N为正常皮肤，T为肿瘤，比例尺50 μm。（E、F）两种模型中各小鼠不同组织类别的点位pH分布。（G、H）动物层面的定量比较，每只小鼠每类组织取测点均值，每种模型6只小鼠。
在动物实验基础上，团队进一步对3例黑色素瘤患者的新鲜切除标本开展研究，共完成145个点位的pH测量，单点从采样到读数约需10秒，各标本均在切除后10分钟内完成测绘，包括必要的质量控制复测（图7）。重建的酸度分布显示出明显空间异质性，肿瘤相关点位的pH总体低于正常组织点位。在另1例独立人源标本的17个配对点位中，模型预测与参考光学pH微传感器测量也表现出较好一致性。
代表性区域的病理对照进一步展示了酸度信息的补充价值：一处肉眼外观不典型的区域pH约为6.52，组织学仍证实为肿瘤；形态正常区域的pH约为7.13；肿瘤与正常组织过渡区域的pH约为6.71，并呈现相应的过渡性病理特征。同一标本内不同肿瘤区域也存在局部酸度差异。尽管人源样本具有复杂生物背景，HemS的主要pH响应谱带仍可识别。这些结果初步表明，局部pH读出能够补充外观观察，提示非典型区域及过渡区域的功能异常，为进一步探索切缘评估应用提供依据。
图7. 人源黑色素瘤新鲜切除标本的pH测绘与病理对照。（A）临床标本检测流程。（B）3例标本及代表性取样位置。（C）对应pH分布，连续色彩图由离散测点插值获得，仅用于可视化。（D）代表性区域的H&E染色及组织边界。（E）同一标本中不同酸度点位的代表性光谱。（F）肿瘤相关及正常组织点位的pH分布。145为3例标本的测量点总数，不代表独立患者数量。
本研究围绕黑色素瘤切缘评估对快速、定量功能信息的需求，将pH响应分子设计、全谱人工智能解析与质量控制结合，建立了面向新鲜手术样本的pH测绘平台。创新点体现在以下三个方面：
（1）以分子响应机制组织全谱信息。设计HemS报告分子，利用质子化与去质子化引起的多谱带协同变化表征pH状态，并通过振动模式归属和量子化学分析建立化学解释，使后续解析能够利用完整的分子响应特征。
（2）以化学先验引导AI定量。构建CIMPA-pH模型，将可学习的化学先验、全谱注意力与酸碱平衡关系结合，在测试数据中提高pH预测表现，同时通过谱区贡献和先验权重展示模型利用化学信息的方式，为可解释光谱分析提供方法参考。
（3）将质量判断纳入空间测绘流程。模型同步输出pH与质量控制风险，引导低可信度读数复测；结合微量水滴取样，在不同色素表型的动物模型及人源新鲜切除标本中获得局部酸度分布，并与参考测量及组织病理结果进行对照。
目前，人源结果仍属于小样本切除标本验证，尚需在更大规模、前瞻性和多中心研究中评估临床效用。由于炎症及部分良性病变也可能产生局部酸化，pH信息需结合组织背景与病理证据解释；水滴取样所反映的是回收水相组分的净酸碱状态，也不能等同于单一代谢物浓度。后续研究还需进一步明确不同皮肤背景、操作差异及检测时间对结果的影响。这些工作将有助于界定平台的适用范围，并推动功能性酸度信息用于黑色素瘤切缘评估。
复旦大学上海市重大传染病和生物安全研究院张杰、复旦大学附属中山医院谢鲤潞、复旦大学药学院赵钰阳为该论文的共同第一作者。复旦大学药学院李聪教授、复旦大学附属中山医院顾建英教授、卫传元主治医师和复旦大学药学院王璐青年研究员为该论文共同通讯作者。该工作获得国家重点研发计划、国家自然科学基金及上海人工智能实验室AI4S的支持。
原文链接：https://doi.org/10.1021/acssensors.6c03332
