癫痫是全球最常见的致死、致残性神经系统疾病之一，累及全球逾 5000 万患者。临床中约30%的患者药物难以控制，为难治性癫痫。对于这类患者，手术切除或消融致痫组织是实现癫痫无发作的最佳手段，但其成功与否高度依赖对致痫网络（epileptogenic network, EN）的精准定位。然而，癫痫病灶高度异质，可分布于海马、皮层及深部脑区：不完全切除可导致60%–75%的术后复发，而过度切除则可能损伤重要功能区。因此，精准识别EN边界是提高手术疗效的关键。
尽管目前已开发出多种EN定位技术，但仍面临诸多临床与技术挑战：（1）术前评估技术（如立体定向脑电图、MRI 及间歇期 PET）存在费用高、耗时长、空间分辨率及灵敏度受限等缺陷，难以提供术中实时指导；（2）术中皮层脑电图（ECoG）空间分辨率有限，且易受麻醉药物对异常放电抑制作用的干扰，需进行长时间监测以捕捉瞬态放电，临床可靠性不足；（3）传统光学成像技术普遍面临内源性信号微弱、电压敏感染料清除迅速、拉曼探针依赖逐点扫描且特异性欠佳等瓶颈。因此，亟需开发兼具高效入脑能力、高时空分辨率、实时稳定性及高灵敏特异性的新型影像技术，通过检测异常放电相关的局部酸化与神经炎症，形成可较长时间保留的稳定光学读出，从而实现EN的长时程定位与精准手术导航。
近日，复旦大学药学院王聪青年研究员、李聪教授、朱校青年研究员、复旦大学附属中山医院李晓宇教授及中国科学院上海药物研究所程震研究员，在国际材料科学领域权威期刊Advanced Materials杂志上发表题为“Cascade-Amplified Ratiometric Fluorescent Probe for Time-Locked Imaging Epilepsy”的研究性论文（图1）。针对癫痫致痫网络精准定位的临床难题，该工作创新性地提出了一种级联放大比率型Förster共振能量转移（cascade-amplified ratiometric fluorescence, CAR-FRET）策略，并成功构建了工程化荧光聚合物探针 CAR-FM，实现了对癫痫致痫网络的高效时间锁定成像与精准手术导航。该研究的主要创新点包括：（1）提出 CAR-FRET 策略：通过距离调控的 FRET 调制与供体-受体化学计量协同，实现了逻辑驱动的乘法式信号放大，使荧光比率增强超过 150 倍，从而显著提升了致痫网络检测的灵敏度与特异性；（2）构建级联放大比率荧光探针CAR-FM：该探针可对癫痫灶的瞬态酸中毒与持续神经炎症进行双重特异性响应，将异常放电相关的短暂酸化与持续氧化应激转化为可累积、较长时间保留的光学信号，实现了长达 100 小时的致痫网络“时间锁定”成像；（3）突破传统手术导航瓶颈：本研究深入揭示了癫痫发作伴随局部酸中毒波动与神经炎症协同的病理特征，在动物实验中，CAR-FM 引导的精准切除疗效显著优于传统ECoG指导，使术后癫痫发作频率和持续时间分别降低了 67.1% 和 66.7%，阳性边缘残留率大幅降低 40.91%。综上所述，该工作成功开发了一种高灵敏、高特异且具备时间锁定能力的致痫网络可视化新工具，为难治性癫痫的精准手术导航及分子影像引导治疗开辟了崭新的维度。
图1. 级联放大比率荧光探针时锁定成像致痫网络的原理示意图。（a）级联放大荧光共振能量转移（CAR-FRET）机制：供体与受体荧光分子距离较近时，经非辐射偶极-偶极耦合高效传递能量，供体/受体荧光比率较低；距离增加后能量转移减弱，比率升高；随后受体分子结构改变、荧光减弱，使比率得到第二级乘法性放大。（b）CAR-FM经受体介导的转胞吞作用穿越血脑屏障。致痫网络内的异常神经元活动导致局部pH降低，使探针解体、I660/I820急剧升高，同时探针表面电荷由负转正，促进细胞摄取。正常脑区生理pH下探针保持完整，细胞内化较少，比率稳定。癫痫相关活性氧进一步破坏受体荧光分子，电荷反转又促进细胞内滞留，从而实现长时间、高对比度的致痫网络成像。
研究团队首先评估了该纳米体系跨血脑屏障（BBB）的靶向基础。免疫荧光染色与定量分析显示，在人类及小鼠癫痫病灶组织的血管内皮中，晚期糖基化终产物受体（RAGE）的表达水平分别约为正常对照组的 3.1 倍和 3.0 倍。基于此高表达靶点，研究者将 RAGE 特异性结合肽（RAP）偶联至两亲性嵌段共聚物中，并通过对 pH 响应模块、供体聚合物与受体聚合物的质量比及靶向基团密度的系统性优化，成功构筑了纳米探针 CAR-FM。理化表征表明，该优化后的探针在生理 pH 条件下可自组装形成粒径约为 40 nm 的均一胶束，为其高效的跨血脑屏障入脑递送及随后的病灶微环境响应奠定了坚实的基础。
图2. CAR-FM的设计与合成。（a）癫痫患者与癫痫模型小鼠的血管内皮（CD31）中RAGE的免疫荧光图像；比例尺：10 μm。（b）血管内皮中RAGE/CD31共染信号的定量。（c）血管内皮RAGE免疫染色强度的定量。（d）通过可逆加成-断裂链转移聚合及巯基-马来酰亚胺偶联制备功能共聚物；其结构包括亲水PEG链段（黑色）、pH响应叔胺基团（橙色）、促进入脑的功能肽（蓝色）以及荧光基团（紫色）。（e）酸碱滴定显示mPEG-b-PC5N、mPEG-b-PC6N与mPEG-b-PC7N的pH转变点分别为7.6、7.1和6.8；不响应pH的对照 mPEG-b-PEH未见转变点。（f）不同质量比例的供体聚合物与受体聚合物组装后，I660/I820荧光比率的筛选；I660为Cy5供体通道，I820为Cy7受体通道。（g）体外Transwell实验中，不同RAP修饰聚合物质量分数对应的血脑屏障穿透效率。（h）CAR-FM组装及荧光比率级联放大机制示意图。
在生理微环境（pH 7.4）下，CAR-FM 保持规整的球形胶束结构，此时荧光供体与受体间距较近，荧光共振能量转移（FRET）效率较高，表现出较低的I660/I820比率。当微环境 pH 降至癫痫弱酸性病灶水平（6.8）时，聚合物中的叔胺基团发生质子化，促使胶束解体，其表面电位随之由 -19.9 mV 显著逆转至 +9.6 mV；随着供受体空间间距的增大，FRET 效应减弱，从而引起比率荧光信号上升。在此基础上，病灶中高水平的ROS进一步诱发受体染料的氧化降解，使其荧光信号进一步猝灭。这种由酸中毒与 ROS 依次触发的双重病理信号级联作用，实现了荧光比率读数的乘法式高效放大，体外荧光比率增强幅度超过 150 倍。相比之下，非 pH 响应型的对照探针则未表现出上述显著的光谱转变特征。
图3. CAR-FM在体外的级联放大比率荧光响应。（a）pH7.4与6.8下CAR-FM及不响应pH的对照探针TFM的透射电镜图像；比例尺：50 nm。（b）相同条件下的水合粒径分布。（c）相同条件下的Zeta电位。（d）酸性条件使CAR-FM胶束解体、I660/I820升高的示意图。（e）不同pH下的荧光发射光谱，以pH 6.8、无活性氧条件下的光谱归一化。（f）不同pH对应的I660/I820。（g）神经炎症相关活性氧诱导受体染料氧化失活、进一步提高I660/I820的示意图。（h）不同活性氧浓度下的荧光发射光谱，同样以上述条件归一化。（i）不同活性氧浓度对应的I660/I820。（j）不同pH与活性氧组合条件下的I660、I820及比率荧光图像，并对比率与两种刺激的关系进行非线性拟合。
在原代神经元细胞实验中，经海人酸（kainic acid，KA）诱导产生痫样放电活动 30 分钟后，细胞内的I660/I820荧光比率显著升高至 3.08±0.20，而正常对照组仅为 0.56±0.05。相比之下，单纯的炎症刺激并未诱发出同等量级的信号响应；而分别加入泮托拉唑、洛拉替尼或两者联合处理后，均观察到探针比率读数的显著下降。上述细胞水平的系列对照实验支持，CAR-FM 对癫痫样神经元的特异性识别源于病灶微环境中酸化与炎症双重指标的协同驱动，而非单一病理因素的贡献。
图4. 神经元细胞痫样活动的比率荧光成像。（a）CAR-FM成像神经元痫样活动的示意：癫痫相关pH下降和活性氧升高促进细胞摄取、荧光比率放大及较长时间的细胞内滞留。（b）原代神经元经KA或PBS处理后，在不同孵育时间的I660、I820和I660/I820荧光图像。（c）图b中I660/I820随时间变化的定量。（d）原代神经元在不同处理下的共聚焦荧光图像：PBS为0.01 M磷酸盐缓冲液，LPS为200 ng/mL，KA为40 ng/mL，Pan为50 ng/mL泮托拉唑，Lor为2 ng/mL洛拉替尼。伪彩图中I660为红色，I820为紫色，比率为灰色，细胞核为蓝色；白色虚线标出细胞，黄色线为荧光强度剖面的位置；比例尺为10 μm。（e）图d的I660和I820荧光强度百分比。（f）图d的I660/I820定量。
进一步，研究团队在KA诱导小鼠模型、海马电点燃小鼠模型、匹罗卡品诱导小鼠模型和KA诱导大鼠模型中评估探针的有效性。KA小鼠致痫区域的I660/I820为4.66 ± 0.34，约为非致痫区域的6.3倍，与64通道皮层脑电定位结果具有空间对应关系。局部炎症模型中的比率信号仅相当于海人酸模型的19.96%；而缺乏靶向基团或 pH 响应模块的对照探针亦无法达到理想的定位效果。上述跨模型、多维度的体内验证表明，该级联放大策略能够有效识别不同空间分布特征的致痫区域；然而，其临床转化效能仍需在更高级别的动物模型与临床前研究中进一步充分验证。
图5. CAR-FM在不同癫痫动物模型中对致痫网络的成像。（a）PBS或KA处理小鼠经尾静脉注射CAR-FM（100 mg/kg）2小时后的活体IVIS成像；白色箭头标示致痫区域。（b）注射CAR-FM后，小鼠脑切片的明场图及I660/I820比率图与Allen脑图谱的叠加图。（c）图b中荧光比率的定量。（d）癫痫小鼠的比率荧光成像流程。（e）KA模型活体及离体的皮层脑电图、I660、I820与比率图；PBS/CAR-FM为模型对照，LPS/CAR-FM为炎症对照，KA/RFM（非靶向）和KA/TFM（不响应pH）为探针对照，白箭头或黄圈标示病灶；比例尺为2.5 mm。（f）图e各组致痫网络I660/I820的定量。（g）图e对应脑切片的Nissl染色；左图比例尺为2.5 mm，右图为100 μm。（h）同侧海马神经元数量定量。（i）海马电点燃小鼠、腹腔注射匹罗卡品小鼠和海马KA注射大鼠模型的皮层脑电图、两个荧光通道及比率图；白色箭头标示病灶，比例尺为2 mm。（j–l）图i中脑电定位与比率成像的致痫区/正常区（E/N）比值。
为解决术中放电难以恰好捕获的问题，研究者利用探针的酸触发电荷转换和细胞内滞留，将术前不同时间出现的短暂酸化事件累积为稳定的荧光空间标记。比率信号在注射后约2小时达到峰值，致痫区与正常区的比值可在最长约100小时内保持高于3。研究者先按皮层脑电结果切除病灶，再用CAR-FM检查术区，发现仍有I660/I820高于3的残留区域，并通过脑片电生理确认其中存在异常神经元放电。荧光辅助识别使皮层脑电引导切除后的阳性切缘率降低40.91%。
图6. CAR-FM在术中定位致痫网络方面与皮层脑电图的比较。（a）给予CAR-M5或CAR-FM5（100 mg/kg）后0-120小时的荧光靶区/背景比模拟；实线为预测中位数，红色与蓝色阴影为90%预测区间，黑虚线为理想阈值，虚线之间表示适宜的术中成像窗口。（b）KA模型小鼠注射Cy5标记的CAR-M5或CAR-FM5（100 mg/kg）后不同时间的连续荧光成像。（c）KA模型的主要药代/药效参数：RSE为相对标准误差，KTR为中心室至靶室的转运速率常数，KE和Kout为相应消除速率常数，Emax为模型估计的最大E/N比值，EC50为达到半最大效应的时间。（d）根据模型模拟的注射后0-48小时荧光强度曲线；实线为预测中位数，阴影表示90%区间。（e）CAR-FM 的双室药代模型与效应室药效模型示意。（f）ECoG引导切除后注射CAR-FM、进行比率荧光成像并对残余组织实施膜片钳验证的流程。（g）皮层脑电引导切除后残余致痫组织的CAR-FM荧光图像；虚线箭头表示三条荧光剖面路径，比例尺：2 mm。（h）沿图g三条路径的I660、I820和比率强度曲线；NT为正常组织，ET为致痫组织，EET为皮层脑电引导切除组织。（i）CAR-FM 指导切除的残留致痫区域离体荧光图，以及相应脑片神经元在60 pA电流注入下的代表性膜片钳动作电位记录；比例尺：2 mm。
在慢性癫痫小鼠的手术治疗评估中，CAR-FM 荧光导航组与ECoG导航组的总体组织切除体积无显著差异，但前者的病灶切除空间精准度更高，能够更完美地覆盖同侧海马致痫核心区。与假手术组相比，CAR-FM 导航组小鼠的术后发作频率与发作总持续时间分别大幅降低了 84.5% 和 84.7%；而与ECoG 导航组相比，上述两项核心疗效指标更是进一步分别显著降低了 67.1% 和 66.7%。这些体内手术干预结果充分表明，CAR-FM 提供的持续性荧光标记策略有助于减少术中残余致痫组织漏检，从而实现更优异的癫痫发作控制。此外，研究团队进一步结合旷场及行为学测试，全面评估了手术切除后的神经功能保护与恢复表现。
图7. CAR-FM引导癫痫小鼠致痫组织切除。（a）术前MRI与PET、手术切除、术后MRI及切除组织三维重建的研究流程。（b）切除的海马组织体积统计。（c）各组代表性脑电波形与能谱。（d）各组癫痫样棘波持续时间的定量。（e）Y迷宫实验示意图。（f）Y迷宫5分钟内行动路径的代表性轨迹频率图。（g、h）5分钟Y迷宫实验中自发交替比例与错误交替比例的定量。（i）旷场实验示意图。（j）旷场实验10分钟内的代表性活动轨迹。（k、l）中心区域进入频率和总活动距离的定量。
该探针能够实现基于时间累积的信号放大，选择性标记神经元高频放电区域，同时降低正常脑组织背景信号的干扰（图8）。这种时间整合型成像方法支持对癫痫活动的术前可视化，并将信号检测与诸如麻醉导致的神经元放电抑制等术中局限性解耦。该探针整合了酸化与氧化应激协同触发的响应机制，通过将短暂的 pH 波动转化为稳定的比率荧光信号来对其进行捕获。探针一旦被激活，可在酸触发电荷转换后增加细胞摄取，并形成较长时间的细胞内滞留，随后暴露于高水平的 ROS 中可进一步放大信号输出。这种逻辑门控响应确保了对病变组织的高特异性，同时最大限度地减少了非病理区域的脱靶激活。图8显示，术前不同时间点出现的酸化事件可促使探针逐步累积，形成持续的空间标记，随后触发 ROS 介导的信号增强，从而留下癫痫活动的持久比率“印记”。这种累积成像策略能够实现高保真的术中可视化，且不依赖于实时放电或麻醉抑制，从而提供了优于ECoG的持久空间分辨率。
图8. 级联放大比率成像与整合分析用于致痫网络定位的机制示意图。（a）发作相关酸化与癫痫相关神经炎症的联合识别提高定位特异性。（b）传统放电相关信号随发作出现和消退，而本策略通过酸化响应与氧化应激放大形成累积信号。（c）CAR-FM成像形成较持久的致痫区域空间标记；ECoG定位依赖采集时段内的电活动，术中可受麻醉影响。Fc和Fe分别表示CAR-FM成像信号与ECoG定位信号在空间和时间上的变化。
总之，本工作提出一种逻辑驱动型比率荧光信号放大机制，开发了一种具备生物降解性、高跨血脑屏障能力的聚合荧光探针CAR-FM，其核心优势包括：（1）高灵敏度：CAR-FM以“类晶体管”方式响应微弱pH波动（响应阈值< 0.2 pH单位），荧光比率信号呈“乘法式”级联放大，倍数超过150倍；（2）长时程成像：突破了现有技术对术中瞬时电信号的依赖，实现了长达100小时的高信噪比显像（SNR > 3），为术中切除提供了稳定、长效的实时导航；（3）定量便捷采集：采用单激发-双发射的比率成像模式，单次激发即可实现精准定量分析，规避了复杂环境干扰。本工作为癫痫神经外科手术提供了全新策略，有望提升耐药性癫痫患者的手术成功率。其集成式的化学设计不仅提升了癫痫灶定位的精度，更为利用分子协同性开发下一代精准神经诊疗方案提供了概念框架。
复旦大学药学院博士生王鑫、黎博涵、李敏、陈运灿和类脑智能科学与技术研究院硕士生汤语睿为该论文的共同第一作者。复旦大学药学院王聪青年研究员、朱校青年研究员、李聪教授，中国科学院上海药物研究所程震教授和复旦大学附属中山医院李晓宇教授为论文的通讯作者。该工作获得国家重点研发计划，国家自然科学基金，上海市启明星项目，复旦大学医工结合项目和克服递药屏障高端制剂全国重点实验室开放课题等项目的支持。
原文链接：https://doi.org/10.1002/adma.202514336
