近红外二区（NIR-II, 1000-1700 nm）荧光成像因其具有良好的组织穿透能力和实时动态高分辨率等优点，可以在亚毫秒至微秒的时间尺度内活体动态监测肿瘤微环境。目前NIR-II 区的荧光探针主要是 “关-开”型探针，此类型荧光探针可以选择性被活体内的特定底物激活，从而给出信号，但它们只能实现“有”和“无”的信号改变，利用“关-开”型荧光探针可以实现对肿瘤微环境中特定底物如酶、 ROS/RNS定性的可视化监测，但不能实现定量变化的监测。相比而言，比率型荧光探针由于可以通过多个通道采集信号再把各通道信号进行关联，具有自我校正功能，可以实现定量分析监测。但截至目前为止，NIR-II区比率荧光探针和探针设计策略都比较少，且能实现检测的底物种类以强氧化性物质为主，不能满足对酶等生物分子的检测需求。基于此，复旦大学雷祖海青年研究员团队开发了一种用于构建第二近红外窗口比率型分子荧光探针的聚甲炔分子平台Py-2，可实现对活体深层组织内酶、ROS/RNS等生物分子的可视化量化监测（图1）。
图1比率型NIR-II探针的生物传感机理
为了评估设计策略的可行性，作者首先进行了量子化学理论计算。结果表明，Py-2和酰化后的分子Rap-M具有近似的能隙和振子强度f值，表明它们可能具有不同的吸收光谱但具有类似的发射光谱性质，有潜力开发成比率荧光探针。进一步合成Py-2和Rap-M并测试发现他们的最大吸收和发射波长分别为965/1010 nm和795/945 nm。作者进一步通过调节Py-2和Rap-M之间的比例来模拟比率荧光信号。使用实验室自己搭建的InGaAs装置，采集不同深度（1%Intralipid）下这些混合物溶液的900 LP和1000 LP荧光，定量分析结果表明，这两个通道的荧光信号衰减与穿透深度的增加同步，不同深度得出的比值保持稳定，表明在不同的穿透深度下比率信号是可靠的（图2）。
图2Py-2作为比率NIR-II荧光探针分子平台的可行性验证
为了证实作者设计的比率荧光策略的实用性，作者分别合成了响应硝基还原酶（NTR）和响应 ROS/RNS的比率型荧光探针Rap-N和Rap-R，体外光谱测试结果表明这两种探针对特定底物都表现出很好的比率荧光响应（图3）。
图3 比率荧光探针光谱测试
鉴于Rap-N探针在体外测试的高灵敏度和特异性，作者进一步研究了Rap-N实时显示体内NTR活性的能力（图4）。选择携带两个皮下4T1乳腺肿瘤的雌性BALB/c小鼠作为模型。作为对照，一侧4T1肿瘤部位用NTR抑制剂双香豆素（肿瘤1）预处理，其荧光信号比（F1000LP/F900LP）约为0.5，在双香豆素组（肿瘤1）中保持不变，另一侧在30分钟内（肿瘤2）达到约0.6，这些结果表明，Rap-N在肿瘤中可被NTR选择性激活。进一步比较不同肿瘤中的NTR活性，作者选择CT-26结肠肿瘤作为另一种肿瘤。4T1肿瘤中的比率荧光信号 (∼0.59）明显高于CT-26肿瘤(∼0.53），结果显示4T1肿瘤表现出比CT-26肿瘤更高的乏氧，免疫荧光染色结果也表明4T1肿瘤比CT26肿瘤更缺氧，双香豆醇可以有效抑制NTR的活性。
图4 Rap-N体内生物传感应用
综上所述，该工作报道了一个NIR-II平台分子Py-2，基于此分子构建了两个比率型分子荧光探针并实现了对活体深层组织内酶、ROS/RNS等生物分子的可视化量化监测。作为平台分子，Py-2可以很方便的被开发成各种检测目的的NIR-II比率型分子荧光探针。
论文第一作者为复旦大学博士后蓝庆春和博士生于朋，通讯作者为复旦大学药学院雷祖海青年研究员。
该工作得到了复旦大学药学院、智能化递药教育部重点实验室、复旦大学化学系、复旦大学先进材料实验室、聚合物分子工程国家重点实验室、国家自然科学基金和上海市科委复旦大学启动经费的大力支持。
雷祖海
一直致力于高性能荧光染料和传感探针的研究。针对荧光活体成像中穿透深度浅和背景干扰的科学问题，在化学与生物传感领域做出了系统的工作，创制多个系列用于生物成像的高亮度、高稳定性荧光染料，提出“共价组装”零背景干扰传感探针设计策略，并开发了系列用于健康相关底物检测的零背景传感探针。以通讯作者和第一作者在国际权威期刊发表论文10余篇，包括Angew（5篇）, JACS（2篇）,Chem. Sci (1篇)。获得中国授权专利4项，美国授权专利1项。作为课题负责人承担国家自然科学基金2项、上海市科委项目2项；入选博士后创新人才支持计划、上海市科技启明星计划。
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