癫痫是脑内神经元异常放电引发的慢性神经系统疾病，全球患者超6800万。尽管抗癫痫药物研发不断推进，仍有约1/3患者进展为难治性癫痫（DRE）。手术切除致痫灶是目前最具潜力的干预手段，但手术预后高度依赖术中对致痫灶的精准定位。致痫灶切除不完整易导致术后复发，过度切除则可能造成神经功能不可逆损伤。现有致痫灶定位技术多依赖电生理与结构影像，组织特异性与实时反馈性不足，难以满足术中精准导航需求。因此，开发兼具病理特异性与空间分辨率的致痫灶可视化策略，对提升DRE手术疗效具有重要意义。
慢性神经炎症与组织结构重塑是癫痫演进的核心病理基础。基质金属蛋白酶-2（MMP-2）作为介导细胞外基质重塑与胶质瘢痕形成的关键酶，可以动态反馈炎症微环境，勾勒癫痫相关病理区域。但神经炎症是脑部疾病普遍病理特征，仅MMP-2酶活性无法特异性区分致痫灶与邻近炎症组织，易造成定位假阳性。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）是神经元凋亡的经典执行分子，是癫痫发作造成神经元损伤的核心病理标志物，但Caspase-3酶活性易受组织异质性与生化背景干扰，易造成定位假阴性。鉴于MMP-2与Caspase-3酶活性分别从炎症重塑与神经元凋亡两个关键维度表征致痫灶，具有高度互补性，且较于癫痫发作期大幅波动的异常代谢标志物，双种酶活性异常更能稳定性反映癫痫持续演进状态，更适用于术中致痫灶识别。基于此，构建“MMP-2初筛定位+Caspase-3精准确认”的双酶联合逻辑门控策略，可在复杂炎症背景中锚定致痫灶活性核心区，提升手术切除的精准性和预后。
尽管双酶联合定位致痫灶具备充分的病理学依据，目前仍缺乏术中对双酶活性实时、同步、高空间分辨率的检测技术。传统免疫分析技术（如ELISA、Western Blot）灵敏度较高，但样本处理繁琐、检测周期长，无法满足术中实时检测需求，且难以提供组织空间分布信息。荧光成像具备空间定位能力，但需注射外源性探针，多通道光谱重叠等因素限制了其应用。术中质谱检测可实现代谢小分子识别，但难以动态反馈酶活性；同时，外源性探针跨血脑屏障效率低、药代动力学差异等问题，也会影响定位准确性。因此，亟需开发快速、定量、抗干扰的多酶活性联合检测分析平台，支撑术中致痫灶可视化。
拉曼光谱凭借独特的分子“指纹”特征可实现分子标志物特异性识别。此外，拉曼峰峰宽狭窄适配多类型标志物同步检测。表面增强拉曼散射（SERS）借助贵金属纳米结构的局域表面等离子体共振，可将拉曼信号放大10⁸–10¹²倍。团队前期工作中，构建了系列SERS阵列，通过将报告元件修饰在纳米金颗粒表面，实现了包括pH、羟基戊二酸等小分子代谢物，前列腺特征抗原（PSA）酶活性等标志物的术中高特异性、高灵敏度、多事件快速监测。然而，上述阵列用于临床组织双酶快速定量仍面临挑战：一是脑组织异质性强，缺乏稳定内参校正信号波动；二是MMP-2与Caspase-3与底物反应动力学不匹配，干扰同步检测准确性；三是双通道复杂光谱对数据解耦提出更高要求。因此，需从底物设计、阵列构建与算法解析多维度协同优化，构建面向术中定位致痫灶的双酶活性分析平台。
近日，复旦大学药学院李聪教授联合王聪青年研究员、戚逸飞副研究员、复旦大学生物医学工程学院余锦华教授和复旦大学附属华山医院邹翔主治医师在Journal of the American Chemical Society杂志上发表了题为：“AI-Assisted SERS Decoding of Dual Enzymatic Activity for Intraoperative Chemical Mapping of Epilepsy”（AI辅助SERS解码双酶活性用于癫痫术中化学成像）的研究性论文。该工作构建了一种基于双通道逻辑门控的AI辅助双酶活性快速响应SERS平台（MC-APA）实现致痫灶术中快速定位（图1）：（1）针对双酶动力学不匹配及固相空间位阻问题，课题组采用数据驱动的AI联合Rosetta结构引导底物延伸策略（SSE-AI），定向设计并筛选出了一条具有快速MMP-2切割能力的十氨基酸多肽，其反应动力学速率与Caspase-3酶相匹配；（2）针对组织异质性引起的信号波动，我们构建了普鲁士蓝掺杂的金纳米星基底（APA），利用氰基在生物静默区的特征峰作为稳定内参，实现酶活性比率定量；（3）为提高复杂拉曼光谱中多目标物同步分析的准确性，建立了联合双分支交叉注意力机制与KAN网络的DBC-KAN模型，高精度捕捉酶反应早期微小变化，实现了双酶活性的快速准确同步预测。结果表明，该平台可在4分钟内完成单点微量样本的双酶活性精准定量，满足术中实时导航需求。通过双通道逻辑门控策略，MC-APA能够有效区分正常脑组织、单纯炎症区域和癫痫核心区，从分子导航层面突破了现有致痫灶定位的局限，为DRE患者精准手术切除提供了理论依据和具有转化潜力的工具。
图1. 构建双酶响应拉曼阵列术中定位癫痫灶。该工作集成了三大核心模块：（左）数据驱动的AI/Rosetta多肽延伸设计策略（SSE-AI）定向优化MMP-2底物，并通过液相酶切动力学和固相阵列拉曼响应测定，筛选出具有快速裂解活性的多肽。（中）构建基于普鲁士蓝（PB）掺杂金纳米星（APA）的生物静默区（BSR）内参SERS阵列，并通过表面特异性修饰酶响应多肽，实现多重酶活性的精准比率定量。（右）基于DBC-KAN模型的AI辅助光谱分析解码多重拉曼信号，实现酶活性成像；结合双通道逻辑门控策略（Cas-3/MMP-2比值定量），实现致痫灶与邻近神经炎症区域的高特异性解耦。
实现双酶同步检测的第一道核心障碍，是两类酶底物的反应动力学严重不匹配。传统常用的MMP-2底物反应速率远滞后于Caspase-3底物：Caspase-3探针5分钟内酶切效率可超50%，而经典MMP-2类似物在相同时长内转化率不足5%，二者的时序错位会直接破坏同步检测的准确性。为从根源解决这一问题，研究团队采用SSE-AI工作流，从头设计具备快速响应特性的MMP-2底物多肽。团队基于已报道的MMP-2底物特异性图谱，通过序列机器学习模型筛选出3个高催化活性、高结合亲和力的六肽核心序列，并利用AlphaFold2 Multimer模拟其与MMP-2结合的空间构象。为最大化酶催化裂隙结合效率、同时适配固相界面的反应空间，研究最终采用十肽架构——这一长度既能充分占据酶的活性口袋，又可将末端拉曼报告分子精准定位在SERS基底约5nm的电磁“热点”范围内，兼顾反应效率与信号增强效果。在此基础上，团队通过算法扩展并优化侧翼氨基酸序列，最终得到先导底物AA-MT多肽。液相色谱对比实验证实，AA-MT的水解动力学显著优于已报道的经典底物：与MMP-2孵育5分钟后，约21%的底物发生降解，反应速率大幅提升；质谱分析确认酶切位点位于丙氨酸-甲硫氨酸连接处，且该底物对MMP-2具有高度反应活性与亚型选择性。后续SERS验证表明，AA-MT的酶解动力学曲线与Caspase-3底物成功匹配，从分子层面解决了双酶同步检测的时序错位难题。进一步的结构与能量分析揭示了其动力学提升机制：传统底物与MMP-2结合过强，陷入“基态过稳定”的无效结合模式，反而阻碍催化周转；而AA-MT避免了活性位点的超锚定相互作用，同时维持稳定的催化构象与适度的动力学灵活性，最终实现了更优的催化通量。
图2. AI优化MMP-2多肽底物的设计与动力学验证。（a）AI加速多肽底物设计的完整工作流程，涵盖计算机序列生成、液相动力学验证及SERS响应性筛选三大环节。（b）SSE-AI设计方案细节：通过基于序列的机器学习模型，筛选出酶切速率与结合亲和力优异的MMP-2六肽核心序列；利用AlphaFold2多聚体模型模拟其与MMP-2的复合物构象，通过RFjoint2将核心序列延伸为丙氨酸填充的十肽骨架；再以固定核心六肽为前提，用Rosetta固定骨架设计/侧链重排优化侧翼残基，最终生成候选十肽底物（如AA-MT多肽）。（c）参比多肽（LG-VR）、文献报道的高评分候选肽（SP-FT、QN-LT、AR-FT）与AI设计候选肽（AA-MT）的液相动力学筛选结果。（d）先导候选肽（SP-FT、AA-MT）与参比肽的SERS酶响应性能对比。（e）AA-MT与MMP-2复合物的代表性计算结构模型，高亮展示催化活性位点内的关键分子相互作用。（f）基于MM/PBSA计算得到的LG-VR与AA-MT的总结合自由能。（g）对应逐残基能量分解结果。（h）LG-VR与AA-MT分子动力学模拟的骨架均方根偏差（RMSD）变化轨迹。
为实现异质性组织微环境中的精准比率定量，研究团队进一步设计构建了普鲁士蓝掺杂的金纳米星SERS阵列（APA阵列）。在复杂生物样本检测中，稳定的内参信号是校正样本差异、保证定量准确性的核心前提。团队选择普鲁士蓝作为内置内参，其特征氰基伸缩振动峰位于1800–2800 cm⁻¹的生物静默区，可完全避开内源性生物分子的光谱干扰，为比率检测提供理想的参照基准。APA纳米颗粒采用分级合成策略制备：首先合成金核@普鲁士蓝壳的前驱体，随后在金分支各向异性生长过程中，界面晶格应变与配体介导的物质传输驱动普鲁士蓝同步迁移，最终被可控掺杂进新生的金刺结构中。最终得到的APA纳米颗粒直径约100nm，呈现高度分支的星形形貌，元素映射显示特征元素沿金刺径向分布，而非局限于颗粒核心，证实普鲁士蓝成功嵌入金分支内部。785 nm激发下的SERS性能测试表明，APA结构中普鲁士蓝的内参信号强度约为单纯核壳结构的8倍，是传统包覆型金纳米星的3.2倍。时域有限差分模拟揭示了增强机制：APA结构的局域电磁场强度|E/E0|可达118，且强电场主要集中在金分支的间隙区域，与普鲁士蓝的空间分布高度重合，因此实现了内参信号的大幅放大。这种内部掺杂设计既保证了参比通道的高信噪比，又完整保留了颗粒最外层的表面活性位点，可用于后续多肽底物的固定。稳定性测试进一步验证了设计可靠性：连续激光照射、宽pH范围、复杂生物介质及长期常温存放均未造成明显信号衰减，普鲁士蓝被牢固包封在金晶格内部，为复杂生物体系中的定量SERS检测提供了稳健内标。
图3. 双酶响应拉曼阵列的制备与结构表征。（a）纳米颗粒分步合成、及在硅片上构建 APA SERS 阵列的流程示意图。（b）（c）分别为Au@PB前驱体与APA纳米颗粒的形貌与元素表征，从左至右依次为：代表性场发射透射电镜图像、暗场扫描透射电镜图像，以及金（Au）、铁（Fe）、氮（N）对应的能谱元素分布图。（d）场发射扫描电镜图像，展示制备得到的APA阵列的整体分布与有序形貌。（e）Au@PB、普鲁士蓝包覆金纳米星（Austar@PB）与APA纳米颗粒的拉曼光谱对比；蓝色阴影区域标注了生物静默区。（f）二维时域有限差分（FDTD）模拟不同纳米结构的局域电磁场增强效应。（g）APA阵列的光稳定性评估。
基于优化的AA-MT底物与APA阵列，研究团队构建了同时响应MMP-2与Caspase-3的MC-APA阵列。研究人员分别在两种底物多肽上修饰锚定基团与拉曼报告分子，通过金-硫配位作用将两种探针共同固定在APA阵列表面，形成双酶响应的SERS检测界面。其检测原理遵循比率型响应机制：MMP-2酶切对应底物后，报告分子脱离金表面，590 cm⁻¹特征峰随酶浓度升高逐渐降低；Caspase-3酶切对应底物后，1100 cm⁻¹特征峰随之下降；而2100cm⁻¹处的普鲁士蓝内参峰始终保持稳定。通过两个比率值，即可分别对两种酶活性进行准确定量。单酶性能测试显示，MMP-2与Caspase-3均具有宽线性范围与低检测限，且两个通道互不干扰，正交性优异。在双酶共存的复杂混合体系中，两种多肽底物可同步、独立发生酶解反应，比率信号与对应酶活仍保持良好线性关系。特异性实验进一步表明，脑微环境中常见的同源蛋白酶、高丰度蛋白均不会引发明显假阳性响应，仅靶标酶可触发特异性信号衰减，且在高蛋白背景下比率信号稳定，充分验证了平台在复杂脑组织环境中的检测可靠性。
图4. SERS阵列对MMP-2与Caspase-3活性的正交定量检测。（a）MC-APA阵列的制备流程示意图。（b）阵列响应MMP-2的选择性酶切作用机制示意图。（c）不同浓度MMP-2（0–200 ng/mL）孵育后，阵列的浓度依赖性拉曼光谱变化。（d）对应的比率型拉曼信号（I590/I2100、I1100/I2100）随MMP-2浓度变化的线性校准曲线。（e）阵列响应Caspase-3的选择性酶切作用机制示意图。（f）不同活性Caspase-3（0–100 U/mL）孵育后，阵列的活性依赖性拉曼光谱变化。（g）对应的比率型拉曼信号随Caspase-3活性变化的线性校准曲线。（h）MMP-2与Caspase-3共同作用时，SERS阵列同步发生双酶切反应的机制示意图。（i）双酶共存体系中，MMP-2依赖的I590/I2100与Caspase-3依赖的I1100/I2100的定量线性拟合曲线。（j）MC-APA阵列对MMP-2、Caspase-3的选择性分析。
术中检测对光谱分析的速度与抗干扰能力提出了极高要求。传统拉曼分析依赖手动选峰积分，易受基线漂移、随机噪声影响，且难以捕捉反应早期的微弱信号；常规深度学习模型也面临双酶信号耦合、早期特征提取困难的瓶颈。为此，研究团队开发了DBC-KAN深度学习模型，实现复杂光谱的快速、高保真解卷积与定量分析。该模型首先将一维拉曼光谱转换为二维格拉姆角和场表征，显式编码谱带间的相关性与全局规律，使模型同时捕捉局部峰强特征与全局谱区关联；针对早期酶活信号微弱的问题，模型引入KAN架构，用可学习激活函数替代传统固定激活函数，大幅提升对反应初期微弱、非线性光谱扰动的捕捉灵敏度；针对双酶信号耦合难题，团队设计了融合通道注意力的双分支交叉注意力模块，通过特征空间深度交互，从机制层面实现两种标志物定量分析的解耦。实验结果显示，在双酶复杂体系中，DBC-KAN成功解耦重叠光谱信号，预测残差控制在±1单位以内，预测波动幅度较传统2D ResNet缩小5倍以上，有效消除了手动分析的操作者偏差与背景干扰。在检测速度上，单张光谱推理耗时不足0.5秒；仅需反应2分钟的光谱即可达到94.29%的分类准确率，较传统模型将诊断时间缩短约8倍；4分钟反应时长下准确率可达98.21%，完全满足术中近实时分子边界导航的时间需求。
图5. DBC-KAN深度学习模型驱动的光谱智能分析与酶活性快速同步定量。（a）传统手动光谱分析、二维残差网络（2D ResNet）基线模型与本研究提出的DBC-KAN深度学习模型的原理对比示意图。（b）DBC-KAN模型架构与工作原理。（c）DBC-KAN模型对复杂背景下Caspase-3（5–100 U/mL）与MMP-2（10–200 ng/mL）活性的预测值与真实值的匹配度。（d）三种分析方法的预测精度与波动幅度对比箱线图。（e）散点图可视化三种分析方法的误差分布与预测稳定性。（f）不同酶促反应时长下三种方法的预测准确率定量对比。
为验证平台的体内应用价值，研究团队构建了神经炎症与局灶性癫痫两种小鼠模型，并以皮层脑电图作为致痫灶定位金标准。针对脑组织采样衔接，团队采用“微液滴原位提取”策略，配合手持式拉曼仪实现网格化点位采集，采用流水线式交错采样与反应模式，总检测时长约4分钟，且不随采样点数线性增长，适配术中大面积测绘需求。研究提出双酶逻辑门控判定策略：正常脑组织双酶均为基础水平（关/关）；单纯神经炎症仅MMP-2升高、Caspase-3低表达（开/关），双酶比值低；致痫灶中两种酶同时显著升高（开/开），双酶比值显著升高。通过这一逻辑，即可从广泛炎症背景中精准筛选致痫核心区。SERS成像结果印证了策略的有效性：MMP-2在两种模型中均广泛升高，无法区分病理状态；而Caspase-3高表达热点仅出现在癫痫模型中，且双酶比值图的热点区域与脑电判定的高频放电区完全共定位。定量分析显示，双酶比值区分致痫灶与神经炎症的AUC高达0.9955，远优于单一标志物，病灶识别整体准确率达95%。组织生化检测、免疫荧光与病理染色均从多维度验证了SERS结果的准确性。
图6. 逻辑门控SERS平台实现致痫灶术中精准分子成像。（a）小鼠模型体内双酶SERS检测定位致痫灶的实验流程。（b）PBS对照组、LPS诱导神经炎症组、KA诱导癫痫组对应的皮层脑电图（ECoG）。（c）MC-APA阵列工作原理：采用双通道逻辑门控策略，依据酶的激活状态差异，区分正常、炎症与癫痫三种组织状态。（d）体内MMP-2与Caspase-3活性拉曼成像结果：左侧为单酶活性SERS空间分布图，右侧为计算得到的Caspase-3/MMP-2比值伪彩图，叠加于暴露脑组织明场照片之上。（e）从图（d）感兴趣区域（1–4）提取的代表性拉曼光谱。（f）（g）分别为体内病灶区单酶活性及逻辑门控Caspase-3/MMP-2比值的定量统计分析结果。（h）（i）采用商用试剂盒定量检测对应脑组织中MMP-2、Caspase-3的绝对活性及二者比值。（j）全脑水平切面共聚焦免疫荧光图（左）及代表性病灶区放大图（右），绿色通道标记MMP-2，红色标记Caspase-3，蓝色标记细胞核。（k）免疫荧光图像中MMP-2与Caspase-3荧光强度的统计定量结果。（l）ROC曲线评估单酶指标与双酶逻辑门控比率区分癫痫与神经炎症的诊断性能，标注对应曲线下面积（AUC）。（m）混淆矩阵展示MC-APA阵列对正常、炎症、癫痫三种脑状态的高精度分类效果。
在此基础上，团队利用4例癫痫患者的手术切除标本开展临床原理验证。电生理确认致痫灶与对照区域的电活动差异后，SERS成像清晰显示：对照组织双酶活性处于低水平，致痫灶区域呈现广泛双酶高表达；比值图可直观区分低比值的正常组织与高比值的致痫区域。免疫荧光与病理结果与SERS检测高度一致，证实该平台可在复杂人体临床标本中准确识别胶质活化与神经元凋亡的病理特征，为术中实时划定致痫灶边界提供了可行的分子影像框架。
图7. 双酶响应拉曼平台实现人体致痫灶术中SERS成像与病理鉴别。（a）MC-APA阵列辅助人体癫痫组织术中快速识别的实验流程。（b）手术切除的人脑组织标本明场图，以及对应感兴趣区域的膜片钳电生理记录。（c）代表性皮层标本的离体双酶活性SERS成像：上排为正常组织，下排为癫痫组织；从左至右依次为MMP-2活性分布图、Caspase-3活性分布图、Caspase-3/MMP-2比值伪彩图；最右侧为对应感兴趣区域提取的代表性拉曼光谱。（d）共聚焦免疫荧光验证临床切片中酶的空间表达分布，三色通道分别标记MMP-2、Caspase-3与细胞核。（e）相邻临床样本的TUNEL凋亡检测与GFAP免疫组化染色；红色箭头标注凋亡细胞核，橙色箭头标注癫痫特征性活化星形胶质细胞。
综上，该研究针对难治性癫痫术中边界精准划定的临床难题，构建了AI辅助SERS检测平台MC-APA解码双酶活性，以术中化学成像致痫灶。本工作主要创新点在于：
（1）AI辅助酶底物工程化改造：提出结构引导的多肽设计策略，整合Rosetta驱动的序列优化技术，定向改造出高反应活性的基质金属蛋白酶-2（MMP-2）底物，将MMP-2的响应速率提升3倍，从分子根源解决了双酶同步检测的动力学不匹配难题。
（2）深度学习解码SERS动态信号：自研DBC-KAN深度学习模型，采用可学习边缘激活函数精准解析早期、重叠的SERS光谱信号，成功解耦双酶动态反应特征，可在4分钟内完成微升级样本的高精度定量检测，诊断准确率达98.21%，为术中检测提供算力支撑。
（3）逻辑门控式致痫灶精准识别：基于上述技术构建双酶逻辑门控SERS检测平台（MC-APA），将MMP-2介导的胶质活化成像与caspase-3介导的神经元丢失分析相结合，可有效区分癫痫脑组织与正常脑组织、单纯炎症组织，显著提升致痫灶定位的特异性与准确性。
复旦大学药学院赵静、陈志航、魏子豪和复旦大学附属华山医院陈铭为本文共同第一作者。复旦大学药学院李聪教授、王聪青年研究员、戚逸飞副研究员、复旦大学生物医学工程学院余锦华教授和复旦大学附属华山医院邹翔主治医师为本文共同通讯作者。该工作获得国家科技部重点研发项目、国家自然科学基金、上海市卫健委协同创新项目、上海人工智能实验室AI4S的支持。
原文链接：https://pubs.acs.org/a/5260077?guestAccessKey=3013eeef-d4f2-4990-afc6-15918eede967
